如何分辨蚁蚕的公母？

如何分辨蚁蚕的公母？

我在参观中国科学院上海植物生理生态研究所时，发现很多研究人员都在解剖家蚕，小蚕宝宝非常可爱。我问这些研究人员是否可以在外形上区分家蚕的性别，但是了解到只能在蛹期和成虫期才能鉴定。那如果蚕农伯伯在蚕业生产上需要尽早知道所养的是雄蚕还是雌蚕，以便根据自己的需要来调节或选择，是否可在幼虫期鉴定性别呢？研究人员说可以尝试用先进的DNA标记技术来对家蚕幼虫的性别进行鉴定。 一、实验意义： 1、 家蚕是一种经济昆虫，与人类的关系密切。蚕丝是我国古代的一项发明，对人类物质文明与精神文明做出过重要的贡献。通过家蚕饲养，对家蚕的生活史有更深的理解，同时可更好地了解家蚕产生蚕丝的过程。 2、 地球上几乎所有的生物都以DNA (脱氧核糖核酸) 作为遗传物质，DNA 是生命活动的基础。通过本实验，可了解和掌握如何从生物组织中提取得到DNA。而从实验中所得到的家蚕DNA又可以在以后用于家蚕的遗传分析，研究家蚕产生蚕丝的质量调控机理，同时为家蚕的品种选育提供指导，以培育优良的家蚕品种。另外本实验是生物学实验的基础，所有家蚕分子生物学的实验都在此基础上展开。 3、 家蚕早期性别的区分对蚕丝生产有着重要的意义。雄蚕由于体格强健，感染病原菌的可能性低，而且产出的丝比雌蚕多，同时雌蚕在制种时又有较多的需求，因此在蚕业生产上希望多饲养雄蚕。但通过外形来鉴定蚕宝宝的性别，只能在蛹和成虫期进行，本实验在幼虫期就可鉴定蚕宝宝的性别，解决了蚕农伯伯在蚕业生产上需要尽早知道所养的是雄蚕还是雌蚕这一难题，在蚕业生产上有重要的经济意义。除此之外，区分雌雄蚕的关键是在于来自父本和母本的遗传信息上存在差异，通过相关标记的开发，可以了解到生物遗传的基本规律。 二、实验目的： 1、掌握家蚕的饲养方法。 2、初步掌握家蚕DNA的提取方法和原理。 3、了解紫外分光光度法测定核酸浓度、纯度的原理、意义和操作方法。 4、利用DNA标记技术鉴定蚕宝宝幼虫的性别。 三、实验原理： 1. 家蚕饲养： 家蚕属于完全变态昆虫，在一个世代中经过卵、幼虫、蛹和成虫四个形态完全不同的发育阶段。成虫交配后再产下下一代，完成整个生命周期。 2. DNA抽提 DNA是生物生命信息的基本内容，通过提取获得目标个体的DNA以便进行进一步的分析。在DNA提取中，所得到的DNA的纯度是衡量本实验是否成功的标志，期间要去除对DNA的纯度影响最大的杂质：蛋白质和RNA。其关键点为：1)用蛋白酶K酶解蛋白；2)用有机溶剂将蛋白质变性，再通过离心作用沉淀蛋白质；3)用RNA酶将RNA 酶解以避免抽提中RNA对DNA的影响 3. 性别区分 家蚕是真核细胞生物的一种。它们的遗传物质分别来自于父本和母本。母本的合子是ZaW，而父本的合子是ZbZb。雌性中Za与雄性Zb的差异会在后代中得以体现。如果是雌性后代，合子为ZbW，如果是雄性后代，合子为ZaZb, 反映在DNA条带上就是雌性为一条带，雄性为两条带。 四、实验材料： 1、 家蚕的卵（用于家蚕的饲养）。 2、 从饲养中获得的家蚕的五龄幼虫（用于DNA的提取和性别鉴定）。 五、实验步骤： 1、 家蚕的饲养： 家蚕以卵繁殖，约经10天左右孵化成幼虫。卵在孵化前2天左右颜色会变黑。刚孵化的幼虫，体呈褐色，形似蚂蚁，又叫蚁蚕。蚁蚕通过摄食迅速生长，体色逐渐变淡转呈青白色。幼虫生长到一定程度时需蜕去旧皮，生长为较宽大的新皮再继续生长，这称为蜕皮。家蚕在蜕皮过程中，新皮形成时需要睡觉，称为眠。眠又是划分蚕龄的界限，蚁蚕摄食后称第1龄蚕，第一次眠后称第2龄蚕，依次类推，第四次眠后称第5龄蚕。每个龄期的眠期长短不一，从数小时到一天。眠期的幼虫不吃不喝。幼虫发育到5龄末期，逐渐停止取食，蚕体收缩，排空消化道，呈透明状，此时叫熟蚕。熟蚕开始吐丝结茧，并在其中化蛹。熟蚕从吐丝至结茧完毕，约2天左右。再经过2-3天，蜕去幼虫表皮化蛹。蚕在蛹期不吃不喝，外观上没有形态变化，但体内却在剧烈蜕变，幼虫器官的解离、改造和成虫器官的发生、形成均在此期间完成。当蛹完成发育后，即蜕去蛹皮，羽化为成虫 ------ 一头漂漂亮亮的披着白色鳞片的蛾子。蛹期经过时间10 – 15 天。羽化后的成虫，从茧内钻出，体内生殖器官已发达成熟，雌蛾、雄蛾交配产卵后，约经7天左右自然死亡，一个世代至此结束。 注意：饲养时，每天喂桑叶3--4次。饲养室温度：三龄及三龄幼虫前控制在28℃左右,四龄及四龄幼虫后控制在25℃左右。饲养室湿度控制在70—75%。饲养室、蚕具要消毒，喂蚕前要清洗双手。 2、家蚕DNA的提取： 从17条家蚕的五龄幼虫体内获取丝腺 丝腺磨碎后，加入提取缓冲液，混匀。 加20mg/ml 蛋白酶 K使终浓度达100ug/ml 50℃ 温浴2小时。每30分钟摇动一次 （作用：去蛋白） 加 10mg/ml的 RNAase(RNA酶)，37℃温浴30分钟(作用：去RNA) 加 等体积酚、氯仿、异戊醇,振荡（作用：去蛋白） 10000g, 4℃,离心10分钟 取上清 加 等体积氯仿,摇匀（作用：去蛋白） 10000g, 4℃, 离心5分钟 取上清 加 1/10体积 3M NaAc(醋酸钠) 加 2×100%乙醇（或等体积异丙醇）(作用：沉淀DNA) -20℃放置10-30分钟 10000g, 4℃, 离心15分钟 弃上清，沉淀用70%乙醇洗2次，(作用：去盐) 离心后倒掉70%乙醇 自然干燥后加入适当体积的双蒸水溶解 用分光光度计测量以上操作得到的DNA样品的浓度。 3、家蚕幼虫性别的鉴定 把在家蚕幼虫中抽提得到的DNA作为模板，用雌雄特异的位点来进行PCR扩增，根据扩增的条带数目对雌雄加以判别。 六、实验结果： 1、 家蚕的饲养： 家蚕属完全变态昆虫，在一个世代中，经过卵、幼虫、蛹和成虫4个形态完全不同的发育阶段。其生活史为： （1） （2） （3） （8） （4） （7） （6） （5） 图1 家蚕生活史 （1）卵、成虫（成虫在产卵） （2）--（6）不同龄期的幼虫[ 图（2）的左上角为蚁蚕 ] （7）熟蚕开始吐丝结茧 （8）蛹（图左）、羽化后的成虫开始从茧内钻出（图右） 2、 家蚕DNA的提取： （1）、样品浓度： 以下的17个样品， 换算得到的原始浓度是：(单位ng/ul) 样品1：85 样品2：98 样品3：84 样品4：75 样品5：86 样品6：84 样品7：79 样品8：86 样品9：84 样品10：80 样品11：90 样品12：75 样品13：912 样品14：961 样品15：1251 样品16：1574 样品17：1618 （2）、纯度分析： 将提取得到的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。 图2：DNA 琼脂糖凝胶电泳图 通过分析上面17 个样品的DNA 琼脂糖凝胶电泳图，得出：前12个样品有RNA的污染， 在电泳图上可以看到RNA条带。后面的5个样品纯度较高，没有RNA的污染，可进一步用于精度高的分子生物学实验，例：家蚕的遗传分析等。 3、家蚕幼虫性别的鉴定 根据PCR扩增的结果，将条带加以检测，检测结果如下图。共选择了两个在性别上有差异的位点。每种位点均用11个雌性个体和11个雄性个体进行扩增，可以明确地看到雌性个体为一种条带，雄性个体为两种条带。位点1与位点2的结果完全一致。这表明，采用所选择的位点可以进行家蚕雌、雄的检测。 所以，通过上述实验证明可以利用DNA标记技术鉴定家蚕幼虫的性别，而且鉴定结果是科学和可靠的。这项探索性的研究仅仅是鉴定家蚕个体性别研究的开始，蚕农可能需要更加直接的方法，例如更为直观的标记来区分雌、雄性。可以利用遗传学的方法寻找与这两个位点连锁的形态标记，来为蚕农提供新的检测途径。相信随着研究的进一步深入，这个目标一定能够达到。 通过外形来鉴定家蚕的性别，只能在蛹和成虫期进行。那蚕农伯伯在蚕业生产上往往需要尽早知道所养的是雄蚕还是雌蚕，以便根据自己的需要来调节或选择，那是否可在幼虫期鉴定性别呢？本项目的成果就可以解决这个难题，用于实际蚕业生产中，具有实用性。