请教测MAPK活性及表达的方法

请教测MAPK活性及表达的方法

是RPTK介导的细胞信号转导，信号的级联放大过程。
受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTKs）
包括6个亚族
?信号转导：配体→受体→受体二聚化→受体的自磷酸化→
激活RTK→胞内信号蛋白→启动信号传导
? RTK- Ras信号通路：
配体→活化酪氨酸激酶RTK→活化的酪氨酸激酶RTK 结合接头蛋白adaptor → GRF（鸟苷酸释放因子）促进GDP释放→Ras（GTP结合蛋白）活化，诱导下游事件：Raf丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（又称MAPKKK）活化（使蛋白上的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化）→活化的Raf 结合并磷酸化另一种蛋白激酶MAPKK，导致MAPKK 活化（MAPKK是一种具双重特异的蛋白激酶，它能磷酸化MAPK的苏氨酸和酪氨酸残基使之激活）→MAPK活化→进入细胞核→其它激酶或基因调控蛋白（转录因子）的磷酸化修饰。

G蛋白偶联受体介导的MAPK的激活
?MAPK（Mitogen-activated protein kinase）又称ERK（extracelular signal-regulated kinase）----真核细胞广泛存在的Ser/Thr蛋白激酶。
? MAPK的底物：膜蛋白（受体、酶）、胞浆蛋白、核骨架蛋白、及多种核内或胞浆内的转录调控因子----在细胞增殖和分化中具有重要调控作用。
? PTX敏感性G蛋白（Gi，Go）的??亚基依赖于Ras激活MAPK，具体机制还有待深入研究；
? PKC、PLC与G蛋白偶联受体介导的MAPK激活
PKC和PLC 参与G蛋白偶联受体激活MAPK ：
? G蛋白偶联受体激活G蛋白； G蛋白?亚基或?? 亚基激活PLC，促进膜磷脂代谢； 磷脂代谢产物（ DAG + IP3 ）激活PKC； PKC 通过Ras 或 Raf 激活MAPK ；
?由于PKC对钙的依赖性不同，所以G蛋白偶联受体– MAPK途径对钙要 求不同；
? PKA对G蛋白偶联受体– MAPK途径的负调控
?迄今未发现和制备出MAPK组成型突变（dominant negative mutant），提示细胞难于忍受MAPK的持续激活（MAPK的去活是细胞维持正常生长代谢所必须）。主要机制：特异性的Tyr/Thr磷脂酶可选择性地使MAPK去磷酸化，关闭MAPK信号。
? cAMP ?， MAPK ?；cAMP直接激活cAMP依赖的PKA；PKA可能通过RTK或通过抑制Raf-Ras相互作用起负调控作

RTKs的失敏：
催化性受体的效应器位于受体本身，因此失敏即酶活性速发抑制。

?机制：受体的磷酸化修饰。EGF受体Thr654的磷酸化导致RTK活性的
抑制，如果该位点产生Ala突变，则阻止活性抑制，后又发现C
端的Ser1046/7也是磷酸化位点。磷酸化位点所在的C端恰好是
SH2蛋白的结合部位。

?引起受体磷酸化的激酶：
PKC----作用于Thr654；
CaMK2（Ca2+和CaM依赖的激酶2）----作用于Ser1046/7
?还发现：EGF受体是CDK的靶蛋白，提示和周期调控有关。

? RTK晶体结构研究表明， RTK激活后形成稳定的非抑制性构象；磷酸化修饰后，形成抑制性构象，引起失敏。

? RTK失敏对细胞正常功能所必须， RTK 的持续激活将导致细胞生长失控。