链接载体和粘性片段时 片段量过多有什么影响

链接载体和粘性片段时 片段量过多有什么影响

T克隆的原理是基于常规PCR反应中所使用Taq聚合酶能够在PCR产物的3‘末端非特异性添加一个A,这样实际上常规PCR产物都含有3端突出一个A的粘性末端.基于这个原理,常规的线性T－克隆载体（PUC18和PUC19等）在其3’末端添加一个T,这样的载体能够和任何PCR产物进行连接克隆,并不需要添加任何特异性的粘性末端位点.这个就是T克隆的原理了.分析原因可能有：1、T载体连接有问题，重新调整目的片段和T载体的比例，重新连接。2、PCR某种试剂出问题了，以前有个师姐就是这样，怎么也扩不出来，让别人带样扩出来了，原来是Taq酶出问题了，你也可以确定一下。

关键是这个粘性末端带的是什么。因为t 载体的末端是突出的t。如果直接是pcr产物，需要考虑，用taq酶扩增的片段可以直接连，如果是高保真酶扩增的片段，需要用taq酶加a尾，大约30min左右。 如果是已经经过酶切的片段，确实要补平加a。如果是这样，为什么不直接去连目标载体呢？