如何选择并调整内参基因

如何选择并调整内参基因

最近我做了荧光定量PCR，每次做的时候溶解曲线效果就很差，不是单一的峰，说明是有非特异性的扩增，但是在普通PCR仪上做的PCR时，只显示了一条带，很清晰，是怎么回事啊?荧光定量的灵敏度太大了么?还有斑马鱼的内参基因怎么选取?做的是相对定量。答：你说对了，荧光定量的灵敏度太大了。你要明白件事情，EB染色的情况下，在电泳上要形成一个条带的前提是存在5ng的DNA,也就是，如果你的非特异性扩增产物低于5ng的话，你在电泳上是观察不到的，但是SYBRGreen染色的情况下，定量PCR可以检测到。你具体PCR的条件我不是很清楚，但是你可以考虑通过以下几个方面来优化，一个是延长解链时间，保证DNA的充分解链，延长扩增时间，保证扩增的完整性，提高退火温度，减少引物和模板的非特异性结合。此外，你的RNA在反转录前用DNase处理，减少基因组的污染，也有助于提高扩增的特异性。你如果检测相对表达，最理想的状态，干脆用特异性引物来反转录，事实上，虽然很多人做相对定量都习惯于用随机引物或者是ologodT来反转录，但是从结果上讲，使用特异引物做反转录最后拿到的结果要更可靠，也更具有特异性。只是反转录的试剂消耗要加倍的，同一个样品你必须单独反转录内参基因和目的基因。如果你要检测其他目的基因，相应消耗。至于内参基因，一般动物细胞的那几个内参基因，Acin，Tubulin,RPL32之类的，最好你能预先检测一下，挑一个最稳定的出来。不要随便用，没有全部通用的内参基因的。………………详细资料请参考：on