美国药典细菌内毒素检测的翻译

美国药典细菌内毒素检测的翻译

美国药典24版细菌内毒素检查法

本文是USP24细菌内毒素检查法（BACTERLAL ENDOTOXINS TEST）的译文，但目前执行的标准是USP24版第二增补本（USP—NF19 Second Supplement）的细菌内毒素检查法，读者可对照学习，从中可看出USP24细菌内毒素检查的不足之处。本文将介绍用鲎试剂检测样品内或样品上存在的细菌内毒素浓度的方法。鲎试剂（Limulus Amebocyte,LAL）来自鲎的循环细胞，经水提取而行，制备和检验后，用于凝固法。
反应的终点是将供检样品稀释后，与平行稀释的参考内毒素标准进行直接比较得到的。测得的内毒素含量用规定的内毒素单位表示。
鲎试剂也是用浊度法或显色法来读取数据的，这些试齐只要能满足这些选择方法的要求，就可以使用。在做试验时，需要先做出一条标准曲线，并用该曲线计算供检样品的内毒素含量，包括样品和对照液加鲎试剂后的培育时间和在分光光度计上读取光密度时使用的波长等操作，都应该事先规定好。如果是终点浊度法，则到达培育期后，应立刻读取读数。而动力学检测（凶手浊度法和显色法），光密度的测定是贯穿于整个反应期间，而用于计算结果的百分数就是从这些读数中计算出来的。在用终点法的显色法检测时，在到达事先规定的反应时间后，添加停止酶反应的试剂使反应停止后，再读取数据。
1、参考内毒素标准与对照内毒素标准
参考内毒素标准（Reference standard endotoxin,RSE）是美国药典（USP）的内毒素参考标准，其效价为每瓶10 000个USP内毒素单位（EU）。每瓶参考内毒素标准加5ml鲎试剂用水（LAL Reagent Watet），用旋转搅拌器间歇搅拌30min使其溶解，制成原液，用这一原液制作合适的系列稀释。原液应保存于冰箱中，用于以后的稀释，但保存时间不得超过14d。用前，用旋转搅拌器强力搅拌至少3min，每一步稀释，至少搅拌30s，然后才能用它稀释下一步。经稀释的参考内毒素不得贮存待以后使用，因为吸附作用会使其失去活性。对照内毒素标准（Contuol standard endotoxin,CSE）是以参考内毒素标准为标准另行制备的。一批新的对照内毒素标准在使用前应进行检定。检定时使用的鲎试剂应为试验中使用的同批鲎试剂。参考内毒素标准对照内毒素标准进行检定时，可使用鲎试剂的凝固法，按“试验操作”进行。每批对照内毒素标准，至少取1瓶与1瓶参考内毒素标准进行对比。参考内毒素标准的每个稀释度作4管。每瓶或每个样品的对照内毒素标准的每个稀释度也都要4管。参考内毒素标准终点的对数Log10的平均值和对照内毒素标准终点的对数Log10平均值之间的差值的反对数等于对照内毒素标准效价的标定值。可根据情况，将其变换成每ng干燥制剂的单位数或每瓶所含的单位数。
适宜的对照内毒素标准的效价应不小于2EU/ng也不大于50EU/ng。
2、试验的准备
鲎试剂的灵敏度应经过确证。试验中使用的所有容器和用具，都必须在≥250℃的烤箱中，用足够的时间进行加热处理、破坏这些用具表面上可能存在的外源性内毒素。
内毒素试验的结果是否可靠，还必须从试验使用的各种用具、溶液、洗涤用品中取样或提取样品，并用适当的方法证明它们对反应没有抑制或拉强或其它干扰作用。可按下述方法进行抑制试验或增强试验。试验中应设置阴性对照。如果鲎试剂的原材料、生产方法或处方发生改变时都要重新进行试验。
3、鲎试剂灵敏度的确认试验
为了确认鲎试剂标签上的灵敏度，每批至少取1瓶样品进行检定。参考内毒素标准（或对照内毒素标准）作2倍系列稀释，稀释成2.0λ,1.0λ,0.5λ和0.25λ。其中λ是鲎试剂标签上的灵敏度EU/ml。
上述4个稀释度和阴性对照都要重复做4管。所得结果的几何平均值的对数应大于或等于0.5λ，小于或等于2.0λ。每一批新的鲎试剂，使用前都必须作标签灵敏度的确认试验。
4、抑制试验和增强试验
用不超过地大有效稀释而检测不出内毒素的样品，不加或内毒素，使最后浓度等于2.0λ,1.0λ,0.5λ和0.25λ。按照试验操作（Test Procedure）项的规定用标准内毒素进行检定。不加和加内毒素的样品管至少做4管。同时，用水稀释上述相同浓度的内毒素和阴性对照各两管，做平行两管试验。按照计算和判定项的方法，计算样品终点内毒素浓度的几何平均值。
如果所得结果大于或等于0.5λ，小于或等于2.0λ,则该样品适合作细菌内毒素检查。
用中和、灭活或除去干扰物质方法或用不超过最大有效稀释度稀释检品后，可重做抑制试验和增强试验。如果用不超过最大有效稀释法，对已知加量的内毒素可以克服抑制和增强作用。则样品可以经过稀释后，再作内毒素检查。
如果在试验条件下，对未处理的样品检查出有内源性内毒素。则该样品不适合用于作抑制或拉强试验。不过，这种样品可用超过滤法将存在的内毒素去掉或做适当稀释、使之适合于作抑制或增强试验。稀释未处理样品（像开瓶溶解或在使用前注射前稀释那样），稀释到检验不到内毒素但不超过最大有效稀释倍数。再用这些已稀释的样品重作抑制试验或增强试验。
5、最大有效稀释度（MVD）
最大有效稀释度是指在使用时将药物溶解或稀释成恰好用于注射或其它非经口途径使用的浓度。有时为了避免给药量的体积（EU/ml）计算。用试剂标签上的灵敏度（EU/ml）λ除限定浓度，就可以得到MVD因子。如果某一试剂的限量浓度是按重量或按药品的活性单位计算（EU/mg或EU/单位）。用限量乘药品在溶液中的浓度，或按标签说明稀释成的浓度（mg/ml或单位/ml）,再除的λ，就可以得到MVD因子是准备试验而使试验有效的限定稀释因子。
6、试验操作
在准备和进行试验的过程中，必须十分注意，避免使样品受到大量的细菌污染。为了定量检测样品中的内毒素含量，常用系列稀释法稀释样品。用几何稀释法，使每上一步稀释较下一步稀释成为定比关系。试验中应设阴性、阳性对照和阳性产品对照。
供试的每一个样品的每一步系列稀释，至少要做重复性2管。标准内毒素的系列稀释应包括至少两个重复管。每一个框架的试管中都必须有一组标准内毒素的系列稀释管。只要每一个框架的环境条件是均一的，一个框架中可以由几个试管架组成。
（1）准备：标准内毒素以及鲎试剂的形状与装量，各个厂家不尽相同。因此，溶解和稀释必须按标签的说明进行。样品和鲎试剂混合物的pH，除另有规定外，必须位于6.0—8.0之间。样品的pH在试验前，可添加灭菌的无内毒素污染的氢氧化钠、盐酸或适宜的缓冲液调整。
（2）操作：取若干10mm×75mm试管或单个的试验管。每管加适量的阴性对照、标准内毒素、样品和阳性产品对照。阳性产品对照由鲎试剂、洗液或提取液添加2.0λ浓度的标准内毒素置中，准确记录试管的放置时间、于37℃±1℃，放置60min±2min,轻轻地取出观察。形成结实的凝胶，翻转180°，停留于原处不动者为阳性，记（+）号。不形成凝胶或形成的凝胶不结实，则判为阴性、记（-）号。拿取试管时，要轻拿轻放，避免不必要的碰撞，而出现假阴性结果。如果阳性产品对照呈阴性或内毒素标准的浓度不落在鲎试剂标签灵敏度2倍稀释的±1之间，或任何阴性对照出现阳性，试验应判为无效。然后计算样品中的内毒素含量。
7、计算和判定
（1）几何平均值的计算：系列稀释最后的阳性管为样品或样品加内毒素管的终点。记录每管的终点浓度E，换算成对数终点浓度e，用下列公式计算终点的几何平均浓度：
终点的几何平均浓度=log-1(∑e/f)
其中∑e为各稀释度对数终点之和；f为各稀释度的重复管安数。
（2）内毒素含量计算：计算被检样品中或被检样品上的内毒素含量（EU/ml，EU/g或EU/mg）时，首先计算出终点浓度E，再乘以稀释因子λ（λ为鲎试剂标签注明的灵敏度）。被检样品的几何平均浓度等于∑e/f的反对数，其中e等于终点浓度的对数，f为被检样品该稀释度的重复管数。
（3）结果判定：如果内毒素含量小于该品种规定的含量界限，则该品种符合规定。

中国药典和美国药典中的细菌内毒素检测法的不同点比较 1、细菌内毒素工作标准品（cse） cp 对cse的用途及效价进行定义“细菌内毒素工作标准品中每1ng细菌内毒素的效价应不小于2eu，不大于50eu” usp未提到cse 2、细菌内毒素检查用水 cp ： 与灵敏度为0.03eu/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水； usp：与鲎试剂在限定的灵敏度下不发生反应的灭菌注射用水或其它水。 cp：用于细菌内毒素定量测定用的细菌内毒素检查用水，内毒素含量应小于0.005eu/ml。 usp： 未提到。 3、实验用具的准备 cp：实验所用器皿需经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃下干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。 usp：使用经验证的除热原程序对所有玻璃器皿和遇热稳定的材料在热空气烘箱中进行除热原，常用的最低温度和最少的时间是250℃下30分钟。 4、内毒素标准品贮备液和标准品溶液的制备 cp： 未提到 usp：rse的效价定为10,000usp eu/支，用5ml鲎试剂检查用水复溶1支rse的全部内容物，用漩涡混合器间歇混合30分钟，并用此原液作系列稀释，将原液置于冰柜中保存不超过14天，作以后的稀释之用，在使用前用漩涡混合器强力混合不少于3分钟，在作下一步稀释前需对前面的稀释液混合不少于30秒，不要贮存稀释液，因为没有数据能证明其不会因为吸附作用而失去活性。 5、供试品溶液的制备 cp：|某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提 用lrw复溶或稀释药品或抽提医疗器械，某些物质可能更适于用其它水性溶液来溶解、稀释或抽提。 对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品需调节被测溶液（或其稀释液）的ph值，一般要求供试品溶液的ph值在6.0-8.0的范围内。 usp：用lrw复溶或稀释药品或抽提医疗器械，某些物质可能更适于用其它水性溶液来溶解、稀释或抽提。 如果需要，可调节待测溶液（或其稀释液）的ph值，以使鲎试剂和样品的混合物的ph范围落在鲎试剂生产商指定的范围内，这通常适用于ph值在6.0-8.0范围内的产品。 6、内毒素限值的建立 cp：药品、生物制品的细菌内毒素限值（l）一般按以下公式确定：l=k/m l 为供试品的细菌内毒素限值，一般以 eu /ml、eu / mg 或 eu / u （活性 单位）表示； k 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以 eu / ( kg · h ）表示，注 射剂 k = 5eu/(kg•h ) ， 放射性药品注射剂 k=2.5eu / （kg· h ) ， 鞘内用注射剂 k = 0.2eu / （kg· h ) ； m 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以 ml / ( kg · h ）、mg / ( kg · h ） 或 u / ( kg · h ）表示，人均体重按 60kg 计算，人体表面积按 1.62m2 计算。注射时间若不足 1 小时，按 1 小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以 0.027 即可转换为 每千克体重剂量（m）。 usp：非经肠道药品的内毒素限值，以剂量定义，等于k/m 除了鞘内给药以外的任何给药途径，k均为5 usp-eu/kg，鞘内给药时，k为0.2 usp-eu/kg，对于非鞘内给药放射性药品，内毒素限值的计算为175/v，v为以ml为单位的最大推荐剂量，对于鞘内给药的放射性药品，其内毒素限值为14/v，对于按以每平方体表面积计算的给药剂量（通常是抗肿瘤药品），计算公式为k/m，其中k=5eu/kg，m为（最大剂量/m2/小时×1.80m2)/70kg。 7、灵敏度复核实验 cp：当最大浓度2.0λ管为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性时，实验方为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）：λc=lg-1(σx/4) usp：|浓度最低的标准品溶液的所有重复管均为阴性，实验方为有效。 用下式计算终点浓度的对数值的平均值，然后再计算该平均值的反对数：终点浓度的几何平均值= antilog(σe/f) σe是稀释系列的终点浓度的对数值之和，f为重复管数，反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值。 8、凝胶法限量实验： cp：溶液制备以添加了内毒素的溶液为“供试品溶液’。---usp：为“经稀释的供试品溶液。 cp：使用稀释倍数为mvd并且已经排除干扰的供试品液来制备溶液a和b。----usp；使用稀释倍数不超过mvd的稀释液来制备溶液a和b cp：在复试中，溶液a需做4支平行管，当所有平行管都为阴性时，供试品溶液符合规定 ------------usp：在复试中，如果溶液a的两支平行管均为阴性，供试品溶液符合规定 usp：如果供试品溶液以不超过mvd的某个稀释倍数稀释，检测结果为阳性时，可进一步稀释供试品溶液但不能超过mvd，再重新进行试验。------cp；无规定。