近期在质粒构建是PCR和酶切后都有目的条带，但是就是连接转化后没有点，或者有点但是是阴性的，哪有问题

感受态不行？
目的片段没有酶切成功？
没有连接上？
载体不行？

都有可能
你可以多做几个对照,如空载体转化、空细胞涂板等等，帮助缩问题小范围
你可以询问实验室其他人员，看看酶是否有问题，感受态是否有问题，抗生素是否有问题，等等
按你给的线索，菌落很少，很有可能是切开的线性质粒没有连上片段，转不进细胞，少量没有切开的空载体转进细胞，形成阴性菌落。问题可能在片段酶切上，建议连T载体再切，或双酶切换成两步单酶切，或换酶切位点，或重新设计保护碱基

pcr的鉴定可信度还是比较高的，当然这是针对确认的结果来说，也就是说通过pcr已经确证了，再去测序，以排除可能性较小的假阳性和克隆过程中产生的突变。 你现在是pcr的问题还没有解决，连阴性都有条带，应该先把pcr的问题解决了。我觉得先要确定你的引物有没有问题？你的阴性对照是否真的“阴性”？是不是pcr体系有污染了，比如水和buffer？等 总之pcr通过了再测序，pcr没通过默认克隆没有成功

连T载体拿去测序 看P出来的是不是你要的条带 要么就是质粒酶切的之后回收的不好 最好在旁边跑一道没有切的质粒 这样能看出来哪条带是切开的质粒