微生物实验室管理制度

微生物实验室管理制度

USP药典 《1117》章节就是这个:良好的微生物实验室操作规范简介 在微生物实验室中，良好的实验室操作规范是基于很多原则，包括以下活动:无菌技术、培养基的控制、菌种的制备、仪器设备的管理、细致的记录和数据的评估、人员的培训。众所周知，微生物测定数据的可变性、可靠性和重现性是基于公认方法的使用和坚持良好的实验室操作规范。培养基的制备和质量控制-培养基的制备 培养基是微生物测定的基础，培养基的质量因而成了保证微生物实验成功的关键。培养基的制备、合理的贮存、培养基的质量检验，能确保提供持续高质量的培养基。在按照可接受的来源和标准中的配方制备培养基的过程中，重要的是选择正确的培养基和成分。与脱水和制备好的培养基一起的还常常伴有供应商的配方和说明。因为不同的培养基可能有不同的制备要求(如:加热、填加物、ph值的调节等)，按照说明确保制备可接受的培养基是重要的。一份描述效期和建议贮存条件的COA是同制备好的培养基一起的，同时附有用于培养基的促生长试验和灵敏度测试的菌种。 水普遍用于微生物培养基的稀释。纯化水是最常用的，但是在有些情况下，也用去离子水和蒸馏水。稀释用水的体积应该记录。 使用脱水培养基和培养基组分来制备培养基时要准确称量。使用己校正的具有适合的称量范围的天平。使用清洁的容器和工具，防止配方中带入外来物质，改变培养基的最终组成。称量也应该记录。 脱水培养基先在水中分散，并完全溶解和灭菌。如果必要可以加热使溶解,但要防止过度加热，因为所有的培养基或多或少有对热敏感的。用于培养基制备的设备应适于加热控制，持续搅拌，溶质混合。培养基变黑(梅特拉反应和非酶的棕色着色剂)通常显示过度加热。当需要向培养基中添加补充物时，添加后应充分混合。 制备好的培养基应放在清洁无菌的玻璃器具中，也可以加入抑制性物质。抑制性物质可以由器具清洁时产生也可由先前贮存在此器具的物质产生。必须确保清洁过程能有效去除残留和异物，确保清洁剂用纯化水充分清洗。参见《1051玻璃器具的清洗》。 培养基的灭菌应根据供应商提供的参数或用户自己的验证。买来的制备好的培养基应提供其使用的灭菌方法的文件。理想的供应商应提供培养基的灭菌保证水平(SAL)，此水平是依靠公认的生物指示剂确定的。湿热高压灭菌是首选的灭菌技术，除了一些为避免培养基中的热敏物质遭到破坏而采用的煮沸方法。通过过滤灭菌对有些配方也是合适的。 培养基的灭菌方法、灭菌条件的效果应通过培养基的灭菌和促生长试验来验证。另外，如果通过湿热灭菌，灭菌周期应经过验证，对选择合适的负载和体积来确保合适的热分布。通常供应商建议采用一个已校正过的灭菌高压锅，在121°灭菌15分钟。通常指培养基达到温度的时间。当灭菌锅负载结构影响加热的速度是时，越多的负载就需要越长的灭菌周期。然而，灭菌的时间取决于培养基的体积和高压锅的负载。灭菌周期中，当温度是慢慢上升时，可能导致培养基的过度加热。因此，必须仔细确认能达到最小的SAL要求的灭菌周期，在过度加热时，抑制培养基降解的趋势。在流体循环完成后，不主张放冷后的培养基中放在灭菌锅中贮存，因为这样可能破坏培养基。不合适的加热或灭菌(对买来的培养基或是内部制备的培养基)可能导致颜色的不同变化，不透明，改变培养基的规格，或是PH发生漂移(与供应商的提议范围)。 通过无菌技术为测试制备的每一批培养基其PH在放冷至室温(25°)后，都应测定。一个扁平的pH计用于培养基表面pH值的测定，浸入式的pH计用于液体的测定。各供应商提供的培养基的pH应该在规定的±0.2的范围内，除非通过验证得到更宽的范围。 制备培养基应对培养皿和试管进行适当如下的检查:有裂纹的容器和盖子;容器内不同的填充体积;有裂纹容器内可导致脱水的结果或是固体培养基表面起皱;溶血;额外黑或颜色改变;可能过冷引起的结晶;过量的气泡;微生物的污染;氧化显示的情况;批号、效期的检查和记录;培养基的灭菌。培养基的贮存 在培养基销售给最终的使用者之前，供应商和生产商是如何运输和贮存培养基应谨慎考虑。生产商在运输和贮存培养基时，应使用那些能尽可能减少失水，温度控制，机械保护装置的条件。 培养基的标识应包括批号、制备，有效期和证书。培养基应根据供应商的说明书贮存。实验室制备的培养基应根据验证的条件贮存。不能将培养基贮存在零度以下，因为太冷的条件下会破坏培养基的结构。保护培养基避免在光照和过高的温度下保存。培养基若要延长贮存，应将培养皿放在密封包装或容器中避免水分流失。 制备的固体培养基在初始容器中的再熔化，只能熔化一次，避免因过度加热和潜在污染影响培养基的质量。推荐采用加热水浴或蒸气加热来熔化培养基。微波炉和加热板经常使用，但是要小心，避免过度加热破坏培养基，避免实验室人员受到玻璃的碎片和烧伤的危险。熔化的培养基应在45°至50°保存不超过8小时。当从浸在水浴中的培养基容器中倾倒时，要小心操作防止水浴产生的水与己灭菌的培养基混合。在倾倒前将容器外表面擦干是明智的。 处理使用过的培养基和过期的培养基应遵守当地的微生物危害安全操作。 质量控制测试 生长培养基可以在实验室中由单独的成分来制备，很多实验室因为他们的使用情况，使用脱水培养基或购买商业化的制备好的装在平皿或玻璃容器中的培养基。生产者企图标准化制备来源于生物的培养基的原料，但是必须经常不可避免的处理这些从生物来源得到的原料的不同，因而批与批之间的不同必须考虑。实验室制备的或是供应商提供的培养基的性能更多的是依靠其制备过程。不适当的培养基的制备对微生物的生长、复壮能引起令人不满意的结果并导致可疑结果。 应对所有的制备培养基进行质量控制测试。工厂内制备的培养基的常规质量测试包括pH、促生长试验和为确定有效期的定期的稳定性测试。 当工厂内制备的微生物培养基是采用适当的制备和已验证过灭菌方法，促生长试验可以仅限于购入的脱水培养基，除非相关药典方法另有说明。如果培养基的制备没有经过验证，每一批的培养基都要进行促生长试验。测试的微生物应根据合适的药典方法选择，或基于供应商的对特殊的培养基的提议，或基于典型的环境中微生物。 培养基的有效期能支持促生长试验显示其性能，满足可接受的标准至到或包括有效期。每一批培养基的货架寿命将依据规定条件组分和配方的稳定性和容器和密封件的型号。 当一批培养基不能满足促生长试验的要求时，应该启动调查，找到原因。调查应包括纠正措施来防止问题的再发生。如果未找到可指认的原因或关于不生长纠正决定是不确定的，则问题批不能使用。 用于诊断目的的试剂，如支持微生物鉴定用的革兰氏染色和氧化酶测试。其拥有的特性与微生物的培养基在质量控制测试中是相似的。根据供应商的说明，选择正确的质量控制用标准微生物进行测试优先于未知样品的诊断测试。 在环境监测中用到的培养基应特别小心。用于关键区域环境监测的培养基更适合双层打包，并最终灭菌。如果关键区域用培养基没有最终灭菌，应进行预培养，并在使用前进行100%检查。防止带入的外来的污染，并防止假阳性。用于表面接触皿的表面凸起培养基应被验证。 微生物菌种的维护 生物样本是最灵敏(delicate)的,因为他们生存能力和特性是依赖于适当的处理和贮存。菌种的处理和贮存的标准是使用者的实验室制定的，采用减少污染的机会和减少生长特性变更。小心一致的处理贮存用菌种是微生物测试结果一致性的重要因素。按药典方法方法使用的菌种应该取自国家菌种保藏中心。可以包括冷冻的、冻干的、斜面培养的或是马上使用的形式。在质量控制测试使用前应进行菌种纯度的确定和菌种的鉴别。马上使用的菌种要求确定纯度、鉴别、接种体大小。鉴定的确认，对通常用的实验室菌种，理想的是进行基因水平的分析(如:使用合适的经过验证的探针进行DNA指纹,RNA基因排序,PCR光电导继电器) 菌种的制备和复壮应该参照供应商的说明书或采用己验证批准的方法。种子批技术被推荐用于贮备用菌种的保存。 从国家菌种保藏中心得到的初始菌种在合适的培养基被复壮、培养。部分的贮备菌种(第一次接种或是传代)是悬浮在抗冷冻培养基中，分装至小瓶中，在零下30°或更低的温度下冷冻，直到使用。如果冷冻在零下70°，或是冻干形式，菌种可以持续的保存。这些冷冻的贮存菌种可以每月或每周接种用作工作菌种。一旦打开，制备了工作悬浮液，不能再冷冻。不能用的部分应该丢弃，以减少繁殖能力损失带来的风险和贮存污染带来的风险。 工作用菌种的接种量应该记录，以防止过量接种增加表型变种。一代的定义是从具有繁殖能力的菌种接种微生物到一新鲜制备的具有促微生物生长能力 和培养基中。任何形式的接种都被当做是一次转移传代。 实验室仪器的维护 多数的仪器(培养箱、水浴、灭菌锅)必须遵从标准验证程序包括安装确认、操作确认和性能确认。另外还要求有定期的校验(通常每年一次)。新的设备，实验室关键的，应该根据QCU 批准的方案进行确认。 用于微生物实验室仪器(如:pH计和分光光度计)应按规定的进度表进行定期的校验和测试，以保证其性能。校验的频率和性能的确认是基于仪器的型号的不同和能产生实验室数据的设备的重要程度的不同。 实验室的布局和操作 实验室的布局和设计应考虑良好的微生物操作和安全。本质是最大程度的减少微生物菌种的交叉污染，微生物样本的处理环境也是重要，因为环境也能引起也污染的可能。 一般情况下，实验室应分成洁净区、无菌区和阳性室。如果可能，处理和培养灭菌产品的周围的环境区域应与阳性区完全分离。但是要将阳性和洁净区完全分开是不可能的，那么有必要采取隔离和无菌操作来减少可能的意外污染。这些隔离包括:防护衣、清洁、消毒程序和仅用于洁净无菌的生物安全柜。对于活的菌种引起的溢出和灾祸的程序应放在现场，所有相关技术人员进行上述方法的培训。 部分样品会出现微生物的生长，要求进一步分析来确定污染源。当发现有菌生长，样品应从洁净区立即转入阳性区。接种，着色、菌种鉴定或其它的调查操作应在实验室的阳性室操作。如果可能，发现有菌落生长的样品在实验室的洁净区是不能被打开的。小心隔离污染的样品和原料将减少假阳性结果。 正在进行取样操作活动的人员不能进入阳性室或在阳性室操作处理除非特别小心，包括穿防护服和手套，退出后仔细清净手。理想状态，受权人员进行样品取样操作时，特别是无菌过程的，不能在阳性操作室附近工作。同样，所有微生物样品都应采用无菌取样技术，包括非无菌样品的取样。如果可能，在规定的完全无菌的条件的取样区域进行操作。 要重点考虑的是样品的污染，它能导致假阳性的出现，除非在过程中特别注意无菌操作。取样间应设计好，这要原料和辅料的取样就可以在受控条件下进行，包括无菌衣和无菌取样设备。对于公用系统的取样，如水系统，在完全无菌的条件下是不太可能的;然而，当样品未采用无菌技术取样时应有记录，其可靠性不可避免的下降。 环境监测的取样方法要求对取样的设备(负载或未负载)进行最小化的无菌处理。如果可能，在对取样环境进行取样时，取样的设备应同时配备培养基，。 实验室中所有的测试，对关键的测试操作，如:最终剂型的无菌测试，散装产品，生物产品用菌种培养，或是生物产品用细胞培养都应在受控的条件下进行，隔离技术也是可以采用的，无菌的微生物测试。己在显示，隔离技术比人为的洁净区域具有更低的环境污染水平，因此，更能减少假阳性结果的产生。隔离系统的验证是重要的，既能保证环境的完整又能防止假阴性结果的产生，假阴性的结果是由化学消毒物质带入。 人员的培训 从事药品生产所有阶段的每一个人员应进行教育，培训，工作经验。微生物测试的要求，对人员，主管，经理的核心教育背景应是微生物专业或是与生物学相关的专业。同时有职责保持技能和经验水平。 操作程序的连贯性在微生物实验室中是必要。这些程序在培训程序中提供了二个目地。第一，这些SOPS描述了一种方法论，微生物学家按照这些SOPS能得到准确的和可重复的结果，同时也能得到培训的基础。第二，通过跟踪这些程序，微生物专家能证明其熟练程度，程序的编号或是标题也能提供鉴别，微生物学家获得的与其工作职责相关的专门培训。 应对每个人员建立与其工作职责相关的培训课程。在具有微生物测试资质之前，不能独立进行相关操作。培训记录应当场记录，在专门的SOP版本中，应有微生物学家的培训证明。 阶段的性能评估在数据记录中是比较明智的。这些性能测试证明了在微生物实验室操作的资质，如卫生，铺平皿，无菌技术，文档和其它微生物学家提意的。 微生物学家具有监管和管理的职责，应具备适当的教育厂内监管技能的培训，实验室安全，进程，实验室调查，写技术报告，相关SOP，和其它与公司流程相关的关键方面如实验室管理职能中提到的。 记录 记录应能充分证明测试是在实验室中通过受控的方法完成的。这包括，但不仅限于以下: 微生物培训和熟练程度的确认; 设备的验证，校验和维护; 测试中的性能(如24小时至7天的流程记录); 培养基的制备，无菌检查，促生长试验和选择能力; 培养基的目录和控制测试; 关键组分的测试应按规定的程序执行; 数据和计算的复核; 报告的复核由QCU或有责任的经理); 偏差的调查; 实验室记录的维护 合适的数据记录和研究对成功的微生物实验室是重要的。最重要的原则是按照SOP规定操作，SOP应是书面化的，并能反映测试的实际操作是如何进行的，实验室笔记本应能提供所有详细的记录，并保证记录的完整。实验室书写至少应包括以下内容: 日期; 测试物料 微生物测试人员名称 操作程序的号码 记录测试的结果 偏差 参数的记录(使用的设备，使用微生物菌种，培养基的批号) 管理员，第二个复核人签名 每一台关键仪器的使用都应在台帐上记录，所有都应根据SOP的要求记录在校正进度表和维护记录上。日志和其它记录形式对实验室记录本起到支持和帮助。设备的温度(水浴，培养箱，灭菌锅)应有记录并可以追踪。 己签发的SOP及其版本应有清楚的记录。数据的改变应用单钱划去并签上日期和缩写。初始的数据不应抹去或复盖。 测试结果应包括初始记数，允许复核者根据最终结果重新计算。数据的分析方法在SOP中应详细描述。 所有的实验室记录应存档避免遗失，现场中应有正式的记录保存和查阅程序。 检验结果的解释 微生物试验结果难以解释，因为下列原因:微生物是普遍存在于自然界中的，又存在于通常的环境污染，由人类支配的很多类型的特殊的有机物。实验室分析人员在样品分析和操作中可能引入微生物污染。微生物可能不是均匀的分布在样品和环境中。微生物的分析结果存在相当大的可变性。因此，从预期结果中获得的微小的不同是没有多大意义的。 因为微生物分析的这些特性，实验分析应非常小心以避免外来的污染，正如本章前面讨论的。同样重要的，从主要微生物观察考虑，结果必须要解释。不仅包括假定污染的种类，而且包括药物成分、辅料或测试环境中存在的有机物。另外，其微生物的生长特性也应该考虑。 当出现的结果与药典正文或其它建立的质量标准不一致时，就应该进行调查。没有满足标准要求的微生物污染，通常有两个明显的原因:可能是实验室的错误或是实验环境产生无效的结果，也可能是产品有一定污染或其它形式的污染使得超出规定的标准或限度。另外一种情况，实验室操作，在多数情况下，应立即通报。 应该对围绕结果的所有情况进行全面的评估。所有实验条件和因应充分考虑，包括数据的漂移，与建立的限度和标准比较。重要的是根据结果的可变性知道观察的统计意义。 实验室环境，对现场取样的保护装置，测试条件下物料的历史数据，物料的种类，特别注意物料中微生物的存活和繁殖在调查中应被考虑。另外，与实验员进行讨论，分析中的实际操作可以得到有价值的信息。来决定结果的可靠性和决定采取和措施。如果可以确定得到不一致结果的明确原因，那么应该采取纠正措施，并记录问题所在。跟踪正式批准和执行的纠正措施，并进行仔细的检查。 如果分析结果是无效的，基于一个可指出的错误，必须记录。实验室应该有证实测试(再测试)的SOP规定，如果必要，再取样。关于再取样，法规和药典没有给出分析结果调查的操作